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肝细胞癌（HCC）是最致命的恶性肿瘤之一，作为最常见的肝癌类型，约占肝癌病例的90%。目前，最常用的HCC生物标志物是血清甲胎蛋白（AFP），但其筛查准确性差异较大，多达60%的肝癌在晚期才被确诊，导致存活率仅为20%左右。因此，HCC的早期诊断对提高患者生存率至关重要。
爱思唯尔旗下全医学信息平台ClinicalKey中，期刊The American Journal of Pathology（《美国病理学杂志》）发表了一项突破性研究，研究者开发了一种新的机器学习模型，它可以提高HCC早期诊断的准确性并监测治疗效果。
肝癌筛查概述
肝癌是人类最致命的恶性肿瘤之一。在早期阶段，肝癌可以通过手术和放射介入治疗治愈。然而，大多数肝癌都是隐匿性的，没有任何症状。因此，60% 以上的 HCC 患者都是晚期患者。治疗晚期 HCC 的方案非常有限，导致晚期HCC的死亡率很高。晚期 HCC 患者的平均生存期为 6 到 20 个月，2 年生存率低于 50%，而 5 年生存率仅为 10%。因此，识别早期 HCC 对于降低肝癌相关死亡风险至关重要。
目前，AFP是筛查 HCC 最常用的指标。然而，不同研究发现AFP 的准确性不尽相同，且AFP 预测 HCC 的临界值也有很大差异。对直径小于 5 厘米的 HCC，AFP 筛查测试的灵敏度为 49% 至 71%，特异度为 49% 至 86%。因此，需要一种更灵敏的早期 HCC 检测工具。
最近，研究发现一组表达频率不一的融合基因在 HCC 样本中表达。其中，四个融合基因，即 MAN2A1-FER、CCNH-c5orf30、PTEN-NOLC1 和 SLC45A2-AMACR 在肝癌样本中高频表达。染色体重组使基因组不同部分的基因相互并置，导致了这些融合基因的出现。MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1 和 SLC45A2-AMACR 等融合基因是肝癌发展的驱动因素。这些融合基因的转录本很容易在 HCC 患者的血清样本中检测到。这些发现表明，有可能通过分析 HCC 细胞脱落到血清中的融合转录本来检测早期 HCC。
研究概述
研究者使用TaqMan实时定量反转录PCR（RT-PCR）对197份血清标本（其中包括从61名HCC患者治疗前后获得的血清样本，以及从无HCC患者获得的75份血清样本）中的9个融合基因转录本的CT值进行定量分析。随后，研究人员根据血清中的融合基因水平生成了机器学习模型，采用留一交叉验证法预测训练队列中的HCC。
HCC中的融合转录本
在肝癌患者治疗前的血清标本中，MAN2A1-FER(100%，61/61)是最常见的融合转录本，其次是SLC45A2-AMACR和ZMPSTE24-ZMYM4(均为62.3%，38/61)。在治疗前肝细胞癌血清中检测到的其他融合转录本分别为PTEN-NOLC1和CCN-C5orf30，分别占总样本的57.4%(35/61)和55.7%(34/61)。较低频率的融合转录本分别为STAMBPL1-Fas(26.2%，16/61)、PCMTD1-SNTG1(16.4%，10/61)和ZNF124-SMYD3(16.4%，10/61)。治疗后，这些融合转录本在肝癌患者血清中的频率显著下降（详见Table1）。有趣的是，30.7%(23/75)的HCC患者MAN2A1-FER也呈阳性，尽管数量较少。
在非肝癌患者中也检测到其他融合转录本，但频率相对较低。其中，7个融合基因MAN2A1-FER，CCNH-C5orf30，SLC45A2-AMACR，ZMPSTE24-ZMYM4，PTEN-NOLC1，PCMTD1-SNTG和STAMBPL1-Fas在肝癌患者血清标本中的表达频率显著增加。表明在HCC患者血清样本中检测到这些融合转录子可能预测患HCC的风险。
关联性分析表明，治疗前血清样本中PTEN-NOLC 1的存在与生存不良和死亡风险增加有关。治疗前血清标本中MAN2A1-FER(36个周期)的高表达也与生存不良有关。治疗后血清样本中持续存在MAN2A1-FER融合转录本(41个周期)与较差生存结果的风险较大相关。此外，如果在治疗后的血清样本中检测到CCNH-C5orf30或ZMPSTE24-ZMYM4，则癌症进展/复发的风险显著增加。
数据以%(n/N)表示。HCV/HBV,丙型肝炎病毒/乙肝病毒；NASH，非酒精性脂肪性肝炎。
血清融合转录本可预测HCC的发生
研究者构建的一个机器学习模型称为四融合基因Logistic回归模型(MAN2A1-FER40、CCNH-C5orf3038、SLC45A2-AMACR41和PTEN-NOLC140)，在训练和测试队列中的准确率分别为91.5%和83.3%，敏感性分别为87.1%和73.3%，特异性为94.1%和95.8%。将训练队列和测试队列整合后，模型的准确率、敏感性和特异性分别为86%，82&和89.3%（详见Figure 1A）。
生存分析显示，在训练队列中，当四融合基因Logistic回归模型预测为非HCC时，96%(49/51)的人存活超过10年，而当预测为HCC时，只有19%(6/31)存活了类似的时间。在测试队列中，84%(26/31)被预测为非HCC的个体存活了5年以上，而只有17%(4/23)被预测为HCC的个体存活了相似的时期。当两个队列组合在一起时，预测为非HCC的个体中有92%(71/77)存活超过5年，在被预测为HCC的个体中有17%(10/58)存活超过5年(详见Figure 1B)。
融合基因模型与AFP融合可提升HCC预测效能
目前的共识是，以400 ng/mL AFP为界值可提示HCC的存在。在训练队列中，以400 ng/mL AFP为界值的诊断准确率为67.2%，敏感性为38.7%，特异性为100%；在测试队列中，准确率为53.5%，敏感性为33.3%，特异性为100%。将两组队列整合后，总体准确率为61.4%。在整合队列中，将AFP阈值降低到200 ng/mL，预测HCC的准确率提高到67%，敏感性为45.9%，特异性为100%。AFP≥400或≥200 ng/mL的患者无一存活100个月，而AFP<400ng/mL的患者中有47.4%（37/78）存活100个月，AFP<200ng/mL的患者中有55.6%（40/72）存活100个月（详见Figure 2）。这些结果表明，高AFP在预测 HCC 的发生方面具有较高的特异性，可作为融合基因模型的补充。
为了研究血清AFP水平对融合基因模型的影响，研究者将716个融合基因模型与血清AFP元件整合在一起。其中一种称为双融合基因(MAN2A1-FER40，CCNH-C5orf3038)的AFP Logistic回归模型，在训练队列中，其准确率为94.8%，敏感性为93.5%，特异性为96.3%。在测试队列和整合队列中也得到了基本一致的稳定结果（详见Figure 3A）。
生存分析显示，在训练队列中，两融合基因的AFP模型预测为非HCC的个体中，96%(27/28)的人存活了超过10年。在那些被预测为HCC的患者中，只有17%(5/29) 存活超过10年。在测试集中，被预测为非HCC的个体的5年存活率为92.3%(12/13)，而被预测为HCC的个体的5年存活率为23%(7/30)。在联合队列中，这两个数字分别是95%和15.2%(详见Figure 3B)。这些结果表明，双融合基因AFP Logistic回归模型是预测肝癌相关生存的有效模型。
41%(25/61)的HCC患者在治疗后其血清样本中的融合转录本完全阴性。然而，大多数患者在治疗后血清中的融合转录本水平部分降低，或者只经历了一些融合转录本的转阴，而另一些则没有。一些患者甚至出现了在治疗前获得的血清样本中没有检测到的新的融合转录本。治疗后不同融合基因的血清转录本的不同动态表明，这些个体的肝癌具有明显的异质性，并可能反映了治疗影响的肝癌肿瘤负荷的动态。
具体而言， 95%(58/61)的HCC患者治疗后血清中MAN2A1-FER转录水平下降。3名MAN2A1-FER转录本没有下降的患者在治疗后不久出现远处转移或HCC进展。SLC45A2 -AMACR和ZMPSTE24-ZMYM4分别下降92.1%和86.8%。值得注意的是，在2例患者中，SLC45A2-AMACR作为新的转录本出现在治疗后的血清中，而在8例患者中，ZMPSTE24-ZMYM4作为新的转录本出现在治疗后的血清中，这其中有7例进展或复发。97.1%(33/34)的患者在治疗后血清CCNH-C5orf30水平下降。在5名患者中，CCNH-C5orf50作为新的转录本出现在治疗后的血清中，且这5名患者都经历了进展、复发或远处转移。以治疗前后血清CCNH-C5orf50转录本的动态变化作为评估HCC进展/复发风险的一个因素时，发现治疗后血清CCNH-C5orf30转录本水平下降＜7个周期与HCC复发/进展的风险增加相关。ZMPSTE24-ZMYM4的动态变化与肝癌进展之间也发现了类似的关联，治疗后血清ZMPSTE24-ZMYM4转录本水平下降＜4个周期，表明HCC复发/进展的风险增加(详见Figure 4)。
临床启示
HCC早期治疗的五年生存率为90%，而晚期治疗的五年生存率仅为20%。与单纯的血清AFP相比，融合基因机器学习模型大大提高了HCC的早期检测率。它可以作为筛查 HCC 和监测 HCC 治疗效果的重要工具。以帮助医生发现可能患有 HCC 的患者。另外，目前临床上的常规做法是让每个有HCC风险的人每六个月接受一次成像分析，这种方法不仅昂贵且效果不显著。本研究开发的预测模型不仅可以降低筛查成本，而且当成像结果不明确时，有助于区分恶性和良性病变。
本文作者：楠哥
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